Полимеразная цепная реакция (ПЦР) диагностика: что это такое

Перечень анализов, проводимых при помощи ПЦР-диагностики расширяется с каждым днём. Что это за метод, как его проводят и в чём его достоинства? На эти и другие вопросы отвечает Владислав Александрович Чередниченко, врач-инфекционист, заместитель директора по развитию «Клиника Эксперт» Воронеж.

Описание

Метод измерений, реализуемый в приборах, основан на измерении с помощью оптического детектора флуоресцентного сигнала, испускаемого в ходе полимеразной цепной реакции под воздействием излучения возбуждения, в каждом цикле температурнокинетической амплификации молекул ДНК, с использованием в ПЦР смеси специфических олигонуклеотидов-затравок, нуклеотидтрифосфатов и фермента полимеразы. Интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна количеству амплифицированных фрагментов ДНК (продукта ПЦР). Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала осуществляется в режиме реального времени за счет введенных в реакцию флуоресцирующих красителей, служащих индикатором увеличения количества искомой ДНК. Измерение происходит в оптической части прибора, результаты измерений выводятся на экран монитора внешнего компьютера в условных единицах, пересчитываемых в различные единицы количества амплифицированных фрагментов ДНК (продукта ПЦР) при помощи ПО (по запросу — массовые доли, проценты, объемные доли, счетная концентрация, массовая концентрация и т.д.).

Конструктивно прибор выполнен в едином корпусе, включающем роторный реакционный модуль с исследуемыми образцами; систему термоциклирования, выполненную в виде никель-хромового нагревателя и вентилятора; и оптическую систему детектирования. В приборе находится до 6 каналов детектирования, выполненных из светодиодов с высокой энергией излучения для возбуждения флуоресценции и фотоэлектронного умножителя с набором светофильтров. Также прибор может модифицироваться специальным каналом для определения плавления нуклеиновых кислот с высоким разрешением (High definition melt -HRM).

Управление прибором осуществляется с внешнего IBM-совместимого компьютера с процессором Pentium IV с тактовой частотой не ниже 2,0 ГГц.

Общий вид прибора Rotor-Gene Q представлен на рисунке 1.

Как подготовиться к ПЦР-анализу

Чтобы выяснить, какая инфекция поразила человека, у него обычно берут кровь, мочу, образцы клеток слизистой из ротоглотки или с шейки матки.

В России кровь по умолчанию рекомендуется сдавать натощак, не менее чем с интервалом в 8—12 часов после приема пищи. Однако за рубежом таких строгих правил нет: считается, что перед походом в лабораторию можно позавтракать без сладкого и жирного, например кашей без сахара и масла, куриной грудкой или яйцом. Так что если у вас был легкий завтрак, кровь сдавать можно. Пить тоже не запрещено, но лучше ограничиться чистой водой без газа.

Если врач назначил мазок из горла на ПЦР-анализ, за три часа до процедуры нельзя есть, чистить зубы, полоскать рот и рассасывать любые таблетки. Непосредственно перед взятием мазка не стоит жевать жевательную резинку. Если нос заложен, перед процедурой нужно как следует высморкаться.

Если в качестве материала выступает моча, ее нужно собирать утром, как только проснетесь, в чистый контейнер для анализов или в вымытую с мылом банку из-под детского питания.

Что делать? 

В поликлинике заставляют купить контейнер для анализов

Правила, по которым нужно сдавать мазок на ПЦР из половых органов, отличаются для мужчин и для женщин. Всем за 1—2 дня до исследования нужно отказаться от секса, а в течение 1,5—2 часов перед исследованием — воздерживаться от мочеиспускания. Женщинам за сутки до процедуры не следует проводить спринцевание, пользоваться свечами и антисептиками для подмывания. Во время менструации сдавать биологический материал нельзя.

Какие заболевания выявляются методом ПЦР

  • Полимеразная цепная реакция, или ПЦР анализ, позволяет выявить в организме человека многие инфекционные заболевания, которые были вызваны вирусами  или возбудителями бактериальной природы, простейшими или паразитарные инвазии.
  • С помощью данного анализа можно обнаружить болезни не только в острой стадии, но и во время инкубационного (скрытого) периода.  
  • Анализ ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач.
  • В устоявшейся клинической практике ПЦР  анализы обычно сдают блоками, на определенные группы конкретных возбудителей. Например:

ПЦР — диагностика инфекций, передающихся половым путем, где одновременно выявляются:

  • бактериальные инфекции,
  • вирусные инфекции,
  • инфекции, вызванные простейшими,
  • грибковые инфекции и др.

ПЦР — диагностика бактериальных инфекций:

  • бруцеллы,
  • гемофилии,
  • кампилобактерии,
  • листерии,
  • микробактерии туберкулеза,
  • микоплазмы,
  • кокковые инфекции,
  • трепонема,
  • хеликобактер пилори.

ПЦР — диагностика  вирусных инфекций, например, грипп,  вирусные гепатиты, герпес и другие.

Виды диагностики

Стандартный метод

Анализ полимеразно-цепной реакции проводится на основе многократной амплификации (удвоения) конкретного фрагмента ДНК и РНК при использовании особых ферментов-праймеров. В результате цепочки копирования получается количество материала, достаточное для исследования.

В ходе процедуры копируется только искомый фрагмент (соответствующий заданным конкретным условиям) и в случае, если он действительно присутствует в пробе.

О том, как проходит ПЦР, рассказывает это подробное видео с полезными схемами:

Другие методы

  • ПЦР , проводимая в режиме реального времени. В этом виде исследования процесс выявления заданного фрагмента ДНК запускается после прохождения каждого цикла, а не после осуществления всей цепочки 30 – 40 циклов. Этот вид исследования позволяет получить информацию о количестве патогена (вируса или микроба) в организме, то есть осуществлять количественный анализ.
  • ОТ-ПЦР (режим обратной транскрипции). Этот анализ используют, чтобы найти РНК с одной цепочкой для обнаружения вирусов, генетической базой которых является именно РНК (например, вирус гепатита С, иммунодефицита). При таком исследовании используется особый фермент — обратная транскриптаза и определенный праймер и на базе РНК строится одноцепочная ДНК. Затем из этой цепочки восстанавливают вторую цепь ДНК и выполняется стандартная процедура.

Плюсы и минусы ПЦР

При отражении плюсов ПЦР следует отметить:

  • чувствительность. Как говорилось выше, даже единичный агент, оставленный возбудителем, позволяет обнаружить инфекцию на ее ранней стадии или если она протекает скрытно;
  • широкий спектр. Например, ПЦР 6 позволяет 1 исследованием выявить целых 6 возбудителей;
  • точность. Ложные результаты при данном методе исследования имеют место быть, но их количество сведено к минимуму;
  • скорость. Как правило, пациент уже на следующий день может забрать готовый результат ПЦР исследования.

Минусы:

  • стоимость. ПЦР-исследование не включено в список исследований в системе ОМС. Дорогое высокоточное оборудование требует оплаты своей работы;
  • требования к соблюдению техники исследования и к профессионализму сотрудников;
  • требования к подготовке.